全细胞生物传感器设计新突破：针对S-腺苷-L-蛋氨酸依赖性甲基转移酶的独特应用

大家好，今天为大家带来的是2024年11 月1 日发表在“Biosensors and Bioelectronics”上的“Designing a whole-cell biosensor applicable for S-adenosyl-l-methionine-dependent methyltransferases ”。

常规的基于全细胞转化的酶突变改造，受检测方式的限制，难以进行高通量的突变体筛选，本研究基于大肠杆菌的

MetR设计了L-同型半胱氨酸生物传感器，该蛋白快速反映了甲基转移后S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）形成导致的细胞内L-同型半胱氨酸积累。使用S-腺苷-l-蛋氨酸（SAM）作为甲基供体，该生物传感器应用于来自拟南芥（AtComT）的咖啡酸3-O-

甲基转移酶的改造设计，经过几轮定向进化，修饰后的酶在将咖啡酸转化为阿魏酸时实现了

13.8倍的改进。最好的突变体的催化效率提高了5.4倍。有益突变体的表征表明，改进的O-

甲基转移酶二聚化对酶活性有很大贡献。当切换并比较不同来源中参与二聚化的

N末端时，这一发现得到了验证。最后，以酪氨酸为底物，进化的AtComT突变体大大改善了阿魏酸的生物合成，产量为3448 mg/L，转化率为88.8%。这些结果对高效O-

甲基转移酶的设计具有重要意义，这将极大地有利于多种天然产物的生物合成。此外，

L-同型半胱氨酸生物传感器在评估基于SAM的甲基转移效率方面具有广泛应用的潜力。

一、体内高通量筛选方法的开发

体内定向进化是全细胞生物催化剂优化的一种有效方法。ComT反应取决于甲基载体S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）的SAM供应和回收。SAM的形成过程涉及使用蛋氨酸作为底物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（MetK）。甲基转移到咖啡酸，将SAM转化为SAH。随后，SAH代谢为L-同型半胱氨酸，L-同型半胱氨酸接受来自5-甲基-四氢叶酸的甲基以形成蛋氨酸（图1a）。基于这个循环，作者开发了一种L-同型半胱氨酸生物传感器，用于快速筛选甲基转移效率。

L-同型半胱氨酸诱导MetR调节大肠杆菌中的蛋氨酸合成。MetR激活metA、metE和metH表达，同时抑制自身的表达。作者在组成型启动子Pgap的控制下克隆并表达MetR蛋白。此后，作者用MetR控制的启动子PmetR调节GFPuv表达，形成质粒pLac7-gap-metR-gfpuv。为了促进ComT活性的L-同型半胱氨酸积累，通过敲除metH、metE和mmuM（将L-同型半胱氨酸转化为蛋氨酸）构建菌株FA03。为避免绕过SAM，作者敲除dcm以产生菌株FA04。用质粒pLac7-gap-metR-gfpuv转化后，细胞GFPuv表达与培养基中的L-同型半胱氨酸浓度密切相关（当低于0.1 mM时）。超过0.1 mM的l-同型半胱氨酸严重抑制了细胞生长（图1b）。为了在筛选时更加方便，作者用β-半乳糖苷酶LacZ代替GFPuv，然后将Pgap-metR和PmetR-lacZ构建到FA04染色体中，产生菌株FA05。

二、高碘酸钠比色法

同时，作者开发了一种用于ComT催化的甲基转移反应的快速比色检测方法，涉及与高碘酸钠的反应。当邻二酚化合物咖啡酸与高碘酸钠反应时，它会转化为赋予黄色的邻醌，而甲基化产物阿魏酸则不会。咖啡酸和阿魏酸反应产物之间的比色差异最大出现在450 nm处（图1c）。咖啡酸浓度和OD450反应产物的吸收呈正相关（图1d）。

图1

三、AtComT的定向进化

作者使用AlphaFold2和AutoDock预测了AtComT与咖啡酸复合的结构。底物结合口袋中与咖啡酸相邻的氨基酸是位点饱和诱变的靶标（图2a）。首先，作者用由氨基酸V314和I317构建的位点饱和诱变文库转化菌株FA05（图2a）。转化体在补充有咖啡酸和X-gal的YM9琼脂上生长。为了尽量减少毒性，作者在筛选中使用了5 mM咖啡酸，它在YM9培养基中对细胞生长几乎没有抑制作用。使用OD 450比色法选择最蓝的菌落在96 孔板上重新筛选。重新筛选产生了5 个突变体;A11是最优的，产生的阿魏酸比野生型酶多1.7倍（图2b;氨基酸替换见表1 ）。A11结构模型显示芳香环在咖啡酸中8.4度的旋转，以及芳香环与H321之间新π疏水相互作用。此外，咖啡酸的羧基与R314形成离子键，与N129形成氢键。

突变体A11被用作与氨基酸A160和H164进行第二轮位点饱和诱变的亲本酶。然后对诱变文库进行高通量筛选。五个突变体中最好的突变体（2E1）产生的阿魏酸分别是突变体A11和野生型酶的1.54倍和2.70倍（图2c）。

为了彻底研究AtComT的结构-功能关系，作者基于突变体2E1生成了全长comt的随机诱变文库。从诱变文库中随机选择并培养了60 个克隆，然后使用HPLC和OD450测定阿魏酸产生。阿魏酸浓度与OD450吸收呈负相关。经过筛选，作者从10 个突变体中选择了6 个阿魏酸生成量升高的突变体。最好的突变体是21D6，它产生的阿魏酸比突变体2E1多69%（图2d）。有趣的是，所有突变都位于AtComT N端的110个残基内（表1 ），表明该片段可能在AtComT活性中发挥重要作用。

突变体21D6在N端螺旋中包含一个取代（F22Y）。为了确认这种取代对酶表达的影响，将其引入野生型AtComT中。这种取代也改善了野生型AtComT的阿魏酸生物合成（图2e），但导致表达量降低。这些结果表明F22Y取代对AtComT活性的有益影响。

由于F22Y替换没有引入稀有密码子（表1 ），作者使用核酸包（NUPACK）（http://www.nupack.org/partition/new）来分析21D6 N端（100 bp）的mRNA二级结构。结果表明，21D6的二级结构比2E1更稳定。具体来说，5'编码区中稳定的发夹似乎会干扰起始密码子AUG和f-Met-tRNA之间的相互作用，从而阻止翻译。人工优化mRNA序列而不改变氨基酸序列，提高ΔG并从发夹基序释放AUG。在表达优化基因（21D6-Opt）后，作者观察到突变酶表达的恢复（图2f）。21D6-Opt中的阿魏酸产量比未优化的21D6突变体中的产量高35%（图2e）。

四、探索N端对AtComT活性的贡献

因为所有突变都是从位于AtComT N端的随机诱变文库获得的（表一，图3a），作者选择从该区域截断120个残基以研究它们的影响。正如预期的那样，截短的蛋白质没有表现出可检测的活性。因此，作者使用120个N末端残基构建了一个基于21D6-Opt突变体的随机诱变文库。由于21D6-Opt突变体的反应中没有剩余的咖啡酸（图2e），因此作者在下一轮筛选中将咖啡酸浓度从5 mM提高到8 mM。经过筛选，突变体28F8与21D6-Opt相比，阿魏酸的产生增加了108%。然后，作者使用28F8作为亲本酶，与120个N末端残基进行第二轮随机诱变，并确定突变体50C2是阿魏酸产量从28F8水平增加最高（30%）的酶。在第三轮随机诱变中使用50C2产生突变体72B3，阿魏酸合成分别比21D6-Opt和野生型水平提高了3.5倍和13.8倍（图2g）。值得注意的是，在8 mM咖啡酸下，表达野生型ComT的菌株的细胞生长受到严重抑制，当突变体的催化能力提高时，这种毒性得到缓解（图2g）。

表一

图2

五、AtComT野生型和突变体动力学参数的测定

为了探索AtComT的催化机制，作者纯化并表征了从各种诱变轮次（2E1、21D6、28F8、50C2和72B3）以及野生型AtComT中获得的突变体。然后作者确定了甲基化的动力学参数（表二）。底物结合口袋（突变体2E1）中的突变提高了底物亲和力和周转次数。位于N末端的突变（突变体21D6、28F8、50C2和72B3）主要提高了周转数，也提高了底物亲和力。总的来说，催化效率（kcat/Km）突变体72B3的水平比野生型水平提高了5.4倍。

表二

六、探索N端突变对酶活性的影响

为了探索突变对酶结构的影响，作者进行了分子动力学（MD）模拟。二聚体结构的稳定性可以通过均方根偏差（RMSD）分析来评估。野生型AtComT、2E1和72B3结构在模拟过程中表现出增加的RMSD值（图3b）。72B3的RMSD显示出适当的收敛，范围接近3.5 Å，轨迹从10 ns开始稳定。与72B3相比，野生型RMSD在模拟过程中波动更大，稳定在15 ns左右，平均为5.5 Å。2E1的RMSD值在野生型和72B3值之间波动。因此，72B3具有最稳定的结构。

由于AtComT的N端参与二聚化，因此作者进行了超速离心分析，以探讨N端突变对AtComT聚合的影响。突变体2E1的二聚体/单体比值（1.74）与野生型AtComT（1.49）相似（图3c和d）。突变体72B3携带本研究中选择的所有N末端突变（图3a），并且具有明显更高的二聚体/单体比值（2.93）（图3e）。

然后，作者使用20 ns MD模拟来检查其他三种咖啡酸O-甲基转移酶的二聚体稳定性，即甘蓝型油菜的BnComT、苜蓿的MsComT和水稻的OsComT。AtComT与BnComT、MsComT和OsComT的氨基酸序列同一性分别为92.3%、77.0%和59.5%。与其他ComT相比，2 ns起的OsComT的RMSD波动不大（<0.1 Å），保持在1.79 Å的平均值附近（图3b）。OsComT二聚体/单体比率确定为22.9（图3f）。结果表明，OsComT二聚体结构最稳定;用OsComT的113个N端氨基酸替换72B3中的107个N端氨基酸后，产生了突变体No72B3。有趣的是，No72B3的RMSD值稳定在1.9 Å左右（图3b），其二聚体/单体比为11.5，比72B3突变体有所改善（图3g）。同时，No72B3将咖啡酸到阿魏酸的形成从72B3水平改善了54%（图3h）。这些结果都表明，N端工程改善了酶二聚化，从而改善了酶活性。尽管二聚体比例较低，但突变体72B3具有与OsComT相似的阿魏酸产生，这可能是由于底物结合口袋突变的贡献（图3h）。

图3

七、阿魏酸生物合成的时程分析

作者测试了No72B3以L-酪氨酸为底物在全细胞催化中合成阿魏酸的能力。酪氨酸解氨酶（TAL）、单加氧酶HpaB、C和NAD（P）H-黄素还原酶（Fre）、No72b3用于构建从L-酪氨酸到阿魏酸的生物合成途径（图4a）。定期收集样品以确定阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸和L-酪氨酸底物浓度。

表达No72B3的菌株产生的阿魏酸在72 小时达到17.76 mM（3448 mg /L）。其88.8%的转化率比表达AtComT菌株的转化率高5.92倍（图4b和c）。在突变菌株中，中间体对香豆酸和咖啡酸从6 小时积累，并在12 小时时浓度分别达到峰值（0.71和11.13 mM），然后逐渐转化为阿魏酸。L-酪氨酸迅速消耗，24小时后几乎没有残留物。相比之下，野生型菌株在同一时期积累了4.6 mM咖啡酸并留下了1.6 mM/L酪氨酸。因此，有效的甲基化将限制咖啡酸的积累并提高L-酪氨酸转化率。

图4